pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达N端融合核外运信号(Nuclear export signal, NES)、Flag标签和APEX2的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。在H2O2存在的情况下，APEX2在1分钟内能快速将生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide, Biotin-phenol)、生物素-4-氨基苯酚(Biotin-4-aminophenol)或生物素-萘胺(Biotin-naphthylamine, Biotin-nap)转化为自由基，这些自由基可以标记20nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外富含电子的氨基酸残基(Tyr, Trp, Cys or His)，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)鉴定相互作用的蛋白(图1)。邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定生物体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1]。 图1. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒pCMV-N-NES-Flag-APEX2的工作原理图。 APEX (Ascorbate peroxidase)是基于来源于豌豆(Pea)或大豆(Soybean)的抗坏血酸过氧化物酶经人工改造获得的新型抗坏血酸过氧化物酶。目前被广泛应用的HRP (Horseradish peroxidase) ，中文名为辣根过氧化物酶，也常应用于邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像，但是APEX和HRP相比的优点有：①APEX在细胞质中均有酶活性：HRP在细胞质中不具有酶活性，因为在细胞质的还原性环境中HRP的4对二硫键无法形成，而且细胞质中钙离子稀少导致HRP的2个Ca2+结合位点空缺，所以HRP只能标记细胞膜外的蛋白，细胞膜内只能标记线粒体、内质网内的蛋白，但是APEX的酶活性不受这些因素限制，APEX可以标记细胞质中的蛋白质。②更好的标记效果：HRP分子量约44kDa，而APEX分子量仅约27kDa，因此APEX对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③反应速度快：在H2O2的催化下APEX可以在1分钟内完成对邻近蛋白的生物素标记，因此APEX可以检测、研究细胞不同时间段“瞬间”的蛋白质间相互作用[2]。 本产品中采用的APEX2是APEX的改进增强版本。APEX2和APEX相比的优点有：①蛋白表达量高：APEX2在哺乳细胞中稳定性更好，因此融合蛋白表达量更高。②酶活性更高：APEX2的酶活性更高，因此可以在融合蛋白表达量较低的情况下更有效的进行邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像[3]。 APEX也常被用于电子显微镜细胞成像(Electron microscopy, EM)，因此也被称作EM标签(EM tag)，其原理是表达APEX融合蛋白的细胞被固定后，加入DAB (3,3'-Diaminobenzidine)底物，在H2O2存在的情况下，APEX催化DAB氧化聚合交联生成局部沉淀，后续用富含密集电子的OsO4对DAB聚合物进行染色产生EM对比，后续用电子显微镜进行成像(图2) [4]。 图2. 碧云天APEX2融合蛋白用于电子显微镜细胞成像(Electron microscopy, EM) 的工作原理图。 碧云天各种邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择，请参考 https://www.beyotime.com/support/BioID.htm 本质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；核外运信号辅助表达的融合蛋白进入细胞质中，表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。 pCMV-N-NES-Flag-APEX2质粒(6281bp)的图谱如下： pCMV-N-NES-Flag-APEX2质粒的主要信息如下： Feature Nucleotide Position CMV promoter 235-818 NES,Nuclear Export Signal 920-949 3X Flag Tag 956-1021 APEX2 1028-1774 3X GGGGS repeats linker 1775-1819 Multiple Cloning Sites 1820-1861 BGH poly(A) signal 1881-2105 f1 ori 2151-2579 SV40 promoter 2593-2922 Neomycin resistance gene 2989-3783 SV40 poly(A) signal 3957-4078 lac operator 4151-4167 CAP binding site 4220-4241 ori 4529-5114 Ampicillin resistance gene 5285-6145 Ampicillin promoter 6146-6250 pCMV-NES-Flag-APEX2表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D3044 pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒).pdf pCMV-N-NES-Flag-APEX2中没有的酶切位点包括： AarI AbsI AccIII AccB7I AcvI AjiI AjuI AleI Aor13HI AscI AsiSI BaeI BanIII BarI BbrPI BlpI BmgBI BoxI Bpu1102I Bsa29I BseAI BseCI BshVI BsiWI BsmBI Bsp13I Bsp1407I Bsp1720I BspDI BspEI BspXI BsrGI BstAUI BstEII BstENI BstHPI BstPI BstPAI Bsu15I BsuTUI BtrI CciNI CelII Cfr42I ClaI Eco72I Eco91I EcoNI EcoO65I Esp3I FseI FspAI HpaI I-CeuI I-PpoI I-SceI Kpn2I KspI KspAI MauBI MreI MroI NotI OliI PacI PalAI PaqCI Pfl23II PflMI PI-PspI PI-SceI PmaCI PmlI PshAI PspCI PspEI PspLI PsrI RgaI RigI SacII SbfI SdaI SfaAI SfiI Sfr303I SgfI SgrAI SgrBI SgsI SmiI SrfI Sse8387I SspBI SstII SwaI TstI Van91I XagI XcmI pCMV-N-NES-Flag-APEX2中的单酶切位点包括： Acc65I AfeI AflII AgeI AhdI ApaI AvrII BamHI BbvCI BmtI BsaBI BsgI BssHII BstBI BstZ17I Bsu36I CsiI DraIII EagI Eco53kI EcoRI HindIII KasI KflI KpnI MfeI MluI MscI NarI NdeI NheI NruI PaeR7I PasI PciI PflFI PfoI PluTI PpuMI PspOMI PspXI PstI PvuI RsrII SacI ScaI SexAI SfoI SgrDI SmaI SnaBI SpeI SspI StuI TspMI Tth111I XbaI XhoI XmaI pCMV-N-NES-Flag-APEX2质粒中推荐使用的测序引物序列如下： CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' BGH-R (1892-1875): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3' pCMV-N-Flag-NES-Flag-APEX2的全序列信息:D3044 pCMV-N-NES-Flag-APEX2-全长序列.txt。

保存条件：-20℃保存。

注意事项：
本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。